Maturação e fecundação "in vitro" de ovócitos de caninos domésticos (Canis familiaris)

Este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar a eficácia de duas temperaturas (370 C e 390 C) e três intervalos de tempo (48, 72 e 96h) comumente usados na maturação in vitro (MIV) de ovócitos caninos, 2) verificar o efeito de hormônios heterólogos: hormônio folículo estimulante (FSH) 0,5µg/ml, estradiol 20µg/ml e somatotropina humana (hST) 1µg/ml; e o efeito de proteínas: 0,4 % albumina sérica bovina (BSA), 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), e 10 % soro de cadela em estro inativado (SCE) na maturação nuclear de ovócitos caninos, 3) observar a influência da condição reprodutiva das doadoras de ovários (folicular, diestro, anestro, piometra, e prenhez) sobre os índices de maturação in vitro ovocitária, 4) verificar a habilidade para fecundação in vitro de ovócitos coletados de fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral, previamente maturados in vitro e adicionalmente, examinar sua capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM-199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v) com 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 1 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH e 0,03 UI/ml de hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento não mostraram diferença estatística no índice de meiose de ovócitos maturados à 37oC ou à 39oC em quaisquer dos intervalos testados (48, 72, 96 horas), embora a proporção de ovócitos que alcançaram metáfase II a 37oC após 72 horas da maturação in vitro, mostrasse uma tendência estatística à significância (p = 0,064), quando comparada àquela dos ovócitos maturados à 39oC. Foi concluído que temperaturas de 37oC e 39oC são similares para maturação in vitro de ovócitos de cadelas. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,05) de retomada da meiose após 72 horas de maturação in vitro foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 0,4 % de BSA. Uma influência positiva sobre a aquisição de metáfase II (MII) foi observada com a suplementação de 1µg/ml de hST no meio de maturação. Ao contrário, ovócitos maturados em TCM 199 com 10 % de soro de cadela em estro não se desenvolveram até o estádio de MII. Os resultados deste experimento mostraram que a suplementação de proteínas e de hormônios ao TCM-199 não facilitam as etapas finais da maturação in vitro de ovócitos de cadelas.No terceiro experimento, os resultados de maturação dos ovócitos não mostraram diferença estatística na progressão do material nuclear até o estádio de MII entre os ovócitos provenientes de cadelas em várias condições reprodutivas (fase folicular: 5,4 %; diestro: 4,2 %; anestro: 4,4 %; piometra: 8,1 % e prenhez: 4,7 %). A retomada da meiose mostrou índices de 24,6 % na fase folicular, 19,6 % no diestro, 16,4 % no anestro, 37,1 % na piometra e 29,2 % na prenhez. Índices positivos e mais elevados de resíduo acima do valor esperado foram observados para as condições de piometra e de prenhez nos estádios de metáfase/anáfase I (MI/AI). Nossos resultados indicam que a maturação nuclear in vitro de ovócitos caninos não é influenciada pela condição reprodutiva in vivo da fêmea no momento da coleta ovariana. No experimento de fecundação in vitro (FIV), 888 ovócitos selecionados através de sua qualidade morfológica superior foram distribuídos em 3 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral da doadora em: a) folicular, b) anestro, c) luteal . Após período de 48 horas de maturação a 37oC em TCM 199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v), com 10 % soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 20 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH, 0,03 UI/ml hCG e 1 µg/ml de hST, os ovócitos eram fecundados in vitro (2x106 espermatozóides/ml) por um período de 24 horas. A percentagem de ovócitos nucleados desenvolvendo-se em embriões foi de 10,1 % (27/ 267). O índice de clivagem (2-8 células) após cinco dias da FIV foi similar nas fases reprodutivas (folicular, anestro, e luteal). Contudo, o índice geral de fecundação foi superior nos ovócitos oriundos de cadelas nos estágios folicular (42,4 %) e anestro do ciclo (34,3 %) comparativamente àqueles provenientes da fase luteal (18,6 %) (p < 0,001). Além disso, foi verificada influência da fase folicular sobre o desenvolvimento de pronúcleos, com os índices nesta fase (24,2 %) sendo estatisticamente diferentes daqueles observados no anestro e na fase luteal (9,6 % e 3,7 %, respectivamente) (p < 0,004). Não foi estabelecida correlação entre a proporção de espermatozóides capacitados ou com reação acrossômica e formação pronuclear e/ou percentagem de clivagem. Em resumo, conclui-se que: a) ovócitos caninos podem ser maturados in vitro de forma similar às temperaturas de 39oC e 37o. b) a adição de hormônios (FSH, estradiol, hST) e proteínas (BSA, SVE, SCE) ao meio TCM 199 não eleva os índices de maturação nuclear até o estádio de MII de ovócitos caninos maturados in vitro. c) em cães, a seleção de ovócitos com base na coleta dentro de um estágio específico do ciclo estral não deve ser usada para prever índices de meiose ou habilidade para desenvolvimento embrionário in vitro. d) ovócitos caninos maturados, fecundados e cultivados in vitro podem se desenvolver a zigotos com até 8 células.

Comparação entre os métodos de coloração panótico rápido e giemsa para o diagnóstico de protozoários do gênero Babesia (Starcovici, 1893) e de riquétsias do gênero Ehrlichia (Ehrlich, 1888) em cães (Canis familiaris) no município de Porto Alegre, RS, Brasil.

O trabalho realizado determinou a freqüência dos gêneros Babesia e Ehrlichia, em 250 caninos com suspeita clínica de hemoparasitose, atendidos no Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (HCV–UFRGS), clínicas e hospitais veterinários particulares. Foi analisada a influência da faixa etária e do gênero dos animais na positividade, assim como comparadas as colorações de Giemsa e Panótico Rápido. A pesquisa dos parasitas no sangue de caninos foi realizada através de esfregaços sangüíneos corados pelos métodos Giemsa e Panóptico Rápido. Das 250 amostras analisadas, 45 (18%) foram positivas para hemoparasitas, sendo que 7 (3%) eram animais com idade igual ou inferior a 1 ano (grupo I) e 38 (15%) animais a partir de 1 ano de idade (grupo II). O Teste Exato de Fisher aplicado aos dados revelou não haver diferença significativa entre os resultados encontrados nos animais do grupo I e do grupo II. A Odds ratio calculada para os dois grupos foi igual a 2,142. Os resultados obtidos através da metodologia proposta em função do gênero dos 250 animais pesquisados, envolveram 144 fêmeas, sendo 29 positivas e 106 machos, sendo 16 positivos. O Teste Exato de Fisher aplicado aos dados revelou também não haver diferença significativa entre os resultados encontrados entre machos e fêmeas de todas as idades. A Odds ratio calculada a partir dos dados encontrados foi igual a 0,7050. Em relação aos resultados obtidos com as colorações utilizadas, das 250 amostras analisadas, 26 amostras foram positivas com o kit Panótico Rápido, sendo 19 (7,6%) positivas para Ehrlichia spp e 7 (2,8%) para Babesia spp. Com a coloração de Giemsa, obteve-se 22 amostras positivas: 21 (8,4%) para Babesia spp e 1 (0,4%) para Ehrlichia spp. Apenas 3 amostras (1,2%) apresentaram-se positivas para Babesia spp nas duas colorações e nenhuma amostra foi positiva para Ehrlichia spp com as duas colorações. O teste de Mc Nemar aplicado a estes dados revelou que houve diferença significativa em relação às amostras positivas para Babesia spp pela coloração de Giemsa e pelo Panótico Rápido. A porcentagem de co-positividade e co-negatividade para as duas colorações foi de 14,3% e 98,2%, respectivamente, perfazendo uma porcentagem de concordância total de 91,2%, enquanto o valor Kappa calculado foi de 0,18. O teste de Mc Nemar apresentou uma diferença extremamente significativa nos esfregaços de animais positivos para Ehrlichia spp com as duas colorações utilizadas. A porcentagem de co-positividade e co-negatividade para as duas colorações foi de 0% e 92,3%, respectivamente, perfazendo uma porcentagem de concordância total de 92%, enquanto o valor Kappa calculado foi de 0 (zero). Com base nesses resultados, pode-se concluir que 18% dos animais analisados foram positivos para os hemoparasitos Babesia ou Ehrlichia e que tanto a variável gênero quanto a idade não apresentaram associação com a positividade. Além disso, o corante de Giemsa mostrou-se mais eficiente para o diagnóstico de babesiose canina, enquanto o kit Panótico Rápido foi mais eficiente para a detecção de erliquiose canina.

Pythium insidiosum: avaliação de imunoterápicos para eqüinos, utilizando-se coelhos como modelo experimental.

A pitiose é uma doença granulomatosa, tendo como agente etiológico Pythium insidiosum De Cock, 1987, que atinge eqüinos, provocando quadro infeccioso na pele e tecido subcutâneo , caninos com apresentação gastrintestinal e cutânea , bovinos com doença cutânea , felinos e humanos, com quadro clinico de arterite, queratite e celulite periorbital. Esta enfermidade é mais prevalente em áreas tropicais, subtropicais ou temperadas. Também animais silvestres podem se infectar pela doença. O gênero Pythium pertence ao Reino Stramenopila, Filo Oomycota, cujos membros caracterizam-se por produção de zoósporos biflagelados durante a reprodução assexuada. O desenvolvimento de pitiose experimental nas espécies naturalmente infectadas não foi ainda relatado, mas os coelhos são sensíveis à inoculação de zoósporos e podem ser usados como modelo experimental para estudo da pitiose. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de 3 processos de produção de imunoterápicos contra pitiose, produzidos a partir do cultivo e posterior maceração ou sonicação, em coelhos infectados experimentalmente com 17.500 zoósporos do oomiceto Pythium insidiosum (cepa CBS 101555). Todos os coelhos foram inoculados com zoósporos 1 mês antes da aplicação dos imunoterápicos. Para avaliação dos imunoterápicos, os coelhos que desenvolveram lesões foram divididos em 4 grupos de 5 animais: Grupo 1 – Tratado com placebo; grupo 2 – tratado com o imunoterápico sonicado; grupo 3 – tratado com o imunoterápico misto e o grupo 4 - Imunoterápico macerado mecanicamente. Todos os animais receberam 8 doses do imonoterápico ou placebo com intervalos de 14 dias. Um mês após a inoculação dos zoósporos móveis, foram iniciadas as medições das áreas inoculadas. Os resultados indicaram que o imunoterápico macerado, utilizado no grupo 4, foi estatisticamente (P<0.001) mais eficiente que os demais, diminuindo em até 71,8% a área dos nódulos provocados pelo Pythium insidiosum, após 26 semanas de avaliação. Neste período 2 coelhos deste grupo foram curados. Os animais do Grupo 2 que receberam o imunoterápico sonicado, não mostraram nenhuma reação, detectando-se aumento de até 221% no tamanho das lesões. Nos coelhos do grupo 3, imunoterápico misto, houve aumento das lesões em 50%. A provável causa deste insucesso com o grupo 2, está na desnaturação dos antígenos protetores através dos processos de sonicação. Os dados gerados nesta tese podem inferir que, futuramente, novas perspectivas se abrem para o estudo da pitiose e seu controle.

Avaliação do selamento apical em canais radiculares obturados com cimentos à base de resina epóxica, na presença ou ausência da lama dentinária

A presente pesquisa avaliou a infiltração apical longitudinal nos canais radiculares preparados quimicamente com ou sem EDTA a 17% e obturados com dois tipos de cimentos obturadores à base de resina epóxica (AH Plus e Sealer 26); bem como avaliou a infiltração transversal em diferentes terços da raiz. Foram selecionados 80 caninos humanos permanentes, superiores e inferiores, em que foram realizados os preparos químicos-mecânicos; sendo as amostras divididas, aleatoriamente, em quatro grupos de 20 dentes. No grupo 1, os dentes foram irrigados com NaClO a 1% e obturados com cones de guta-percha e cimento Sealer 26; no grupo 2, os dentes foram irrigados com NaClO a 1% seguido de irrigação com EDTA a 17%; no grupo 3, os dentes foram irrigados com NaClO a 1% e obturados com cones de guta-percha e cimento AH Plus; no grupo 4, os dentes foram irrigados com NaClO a 1% seguido de irrigação com EDTA a 17% e obturados com cones de guta-percha e cimento AH Plus. As amostras foram fixadas em uma lâmina de cera, colocadas num recipiente raso contendo nanquim, durante 14 dias. Após, as amostras sofreram o processo de diafanização permitindo a visualização de forma tridimensional da estrutura dentária. Logo a seguir, foi utilizado microscópio estereoscópico para medir a infiltração longitudinal apical com auxílio de uma tela milimetrada. Com relação à infiltração transversal, após a diafanização e a medição da infiltração longitudinal apical, as amostras foram seccionadas com gilete, em três fatias, nos três terços (cervical, médio e apical). Cada fatia de dente foi colocada no microscópio estereoscópio e, em cima dessa fatia, colocada a tela milimetrada. Observaram-se, nos cortes transversais, a área total da amostra e a área infiltrada pelo corante e estabeleceu-se a porcentagem de infiltração em cada terço da raiz. Partiu-se para a análise dos resultados através dos testes estatísticos ANOVA e do teste Qui-Quadrado. Concluiu-se que não houve diferenças estatisticamente significativas entre os cimentos e ou entre os grupos estudados quanto à infiltração longitudinal apical e transversal. Ambos os cimentos apresentaram um bom selamento longitudinal apical e transversal, e o EDTA não influenciou esses resultados.

A Influência genética das dimensões das arcadas dentárias em indivíduos gêmeos

As pesquisas científicas e clínicas normalmente concordam que os fatores genéticos são de maior significado do que os fatores ambientais para o desenvolvimento das maloclusões. Os estudos em gêmeos semelhantes tentam comprovar esta afirmativa. A aplicação do método para avaliar a variância genética e ambiental em gêmeos envolve a hipótese de que não existem desigualdades médias ou variação total entre os gêmeos monozigóticos. Por outro lado, os gêmeos dizigóticos compartilham 50% do seu genótipo. Estimativas de herdabilidade (h2) foram obtidas para uma série de traços oclusais em trinta e seis pares de gêmeos usando método imparcial desenvolvido para variâncias de heterogeneidade entre as zigosidades. As correlações das herdabilidades (r) não foram significativas (∝=0,05) para os traços de largura entre os caninos superiores e inferiores, largura entre os primeiros molares superiores, profundidade das arcadas superiores e inferiores, relação vertical e horizontal anterior, relação sagital entre os molares, diastemas superiores e apinhamento inferior. Porém, para a presença de diastemas inferiores e a ocorrência de apinhamento superior na região anterior das arcadas, a herdabilidade variou de 73% a 95%. Quanto as simetrias dentárias e das arcadas, dentro e entre os pares de gêmeos, os resultados indicaram a concordância (H) de até 80%, principalmente nos gêmeos monozigóticos.

Manejo dentário em leitões efeitos no ganho de peso na maternidade e creche, prevalência de abcessos periapicais e isolamento dos agentes bacterianos envolvidos.

O corte ou desgaste dos dentes dos leitões recém nascidos é uma prática comum na suinocultura, com o objetivo de reduzir lesões cutâneas na face dos leitões e no aparelho mamário das matrizes. Para avaliação da presença de lesões dentárias, foram analisados após eutanásia 280 animais que apresentavam sinais clínicos de definhamento (refugagem) compatíveis com uma forma de infecção por circovírus (síndrome da refugagem multissistêmica). Entre esses, 58 leitões (21%) apresentaram ao menos um abscesso periapical (total de 70 abscessos), onde: 3os incisivos superiores, 3os incisivos inferiores, caninos superiores e caninos inferiores foram respectivamente responsáveis por 31%, 23%, 6%, e 33% dos abscessos. Outros dentes foram responsáveis por 7% do total de abscessos. A prevalência de abscessos predominantemente nos dentes 3os incisivos e caninos inferiores sugere que estes dentes sofreram maior área de corte/desgaste, refletindo em superior prevalência de abscessos periapicais. Dentre as bactérias classificadas, o Streptococcus sp. foi a mais isolada (21,48% dos isolados em aerobiose e 27,7% em anaerobiose). Houve um isolamento significativamente maior de bactérias corineformes em atmosfera anaeróbica, quando comparado com isolamentos em aerobiose. Houve preponderância de isolamentos de bactérias Gram positivas. Através de um experimento a campo em granja de produção de leitões, foram avaliados 7 tipos de manejos dentários, medindo a influência dos mesmos na variável ganho de peso na maternidade e creche. Nenhuma entre as técnicas avaliadas mostrou diferença estatisticamente significativa.